УДК 577.2
DOI: 10.25630/PAV.2018.95.11.007

Е.О. Шмелькова, М.А. Слугина, А.А. Мелешин, Е.В. Романова

Работа посвящена разработке и тестированию универсальных праймеров для ПЦР-амплификации полноразмерных генов-ортологов β-фруктофуранозидазы (кислой вакуолярной инвертазы) у видов и сортов картофеля (Solanum tuberosum). Крахмал – основной источник энергии и резервный углевод, накапливающийся в амилопластах клубней. Образовавшаяся в результате фотосинтеза молекула глюкозы при реакции с фруктозой образует сахарозу – основную транспортную форму углеводов в растении. В клубни сахароза доставляется по флоэме (апопластный путь), где в межклеточном пространстве расщепляется до глюкозы и фруктозы, которые затем проникают в клетки паренхимы. Глюкоза служит в дальнейшем субстратом для синтеза крахмала в амилопластах. Однако при воздействии пониженных температур крахмал в клубнях картофеля разрушается до редуцирующих сахаров. Параллельно этому процессу идет ресинтез сахарозы до глюкозы и фруктозы за счет фермента кислой вакуолярной инвертазы (β-фруктофуранозидазы), кодируемой геном Pain-1. В совокупности эти процессы приводят к избыточному накоплению моносахаров в клубнях картофеля, так называемому холодовому осахариванию (cold-induced sweetening). При этом создаются условия для интенсивного образования меланоидинов, вызывающих потемнение мякоти картофеля, что значительно ухудшает товарное качество продукта. Таким образом, изучение гена Pain-1, кодирующего вакуолярную инвертазу, а именно, его идентификация и анализ структуры – важная задача, необходимая для поиска доноров, устойчивых к холодовому осахариванию. Первоочередная задача для этого – разработка и тестирование праймерных комбинаций, позволяющих амплифицировать полноразмерный ген у диких видов картофеля, а также сортов и линий культивируемого картофеля (S. tuberosum). В данной работе приведены результаты разработки и тестирования универсальных праймеров, с помощью которых можно амплифицировать как полноразмерные гены-ортологи, так и фрагменты гена Pain-1, а также подобраны оптимальные условия для проведения ПЦР реакции. Было разработано 6 праймерных комбинаций (PainF – PainR, PainF – Pain1exR, Pain1exF – Pain3exR, Pain2inF – Pain2inR, Pain3exF – Pain5exR, Pain5exF – PainR), среди которых комбинация PainF – PainR позволяла амплифицировать полноразмерный ген, остальные – внутренние и будут использованы в дальнейшем при секвенировании фрагментов исследуемого гена. Эти праймеры были успешно протестированы на 15 образцах, включающих представителей пяти дикорастущих видов картофеля (S. gourlay, S. chacoense, S. pinnatissectum, S. stoloniferum, S. vernei) и десяти сортов российской и зарубежной селекции (Гала, Ласунок, Ред Скарлетт, Рассет Бербанк, Мирас, Башкирский, Жуковский ранний, Матушка, Елизавета, Сударыня).

Ключевые слова: кислая вакуолярная инвертаза, Pain-1, β-фруктофуранозидаза, разработка праймеров, селекция картофеля, холодовое осахаривание. Читать далее →